Routinebeobachtungsmethoden und Vorsichtsmaßnahmen der Zellkultur
Routinebeobachtungsmethoden und Vorsichtsmaßnahmen der Zellkultur
Nachdem die Zellen inokuliert oder subkultiviert wurden, sollte der Experimentator die Zellen jeden Tag oder höchstens 1 bis 2 Tage routinemäßig untersuchen. Beobachten Sie die Morphologie und das Wachstum der Zellen sowie die pH-Änderung der Kultur, ob Verschmutzung usw. vorliegt. Führen Sie je nach dynamischer Zellveränderung einen Flüssigkeitsersatz oder eine Passagebehandlung durch. Wenn anormale Bedingungen festgestellt werden, ergreifen Sie rechtzeitig Maßnahmen.
1. Zellen mit gutem morphologischem Wachstumszustand sind unter dem allgemeinen Mikroskop mit großer Transparenz, starker Brechung und unklarem Umriss zu sehen. Wenn Zellen schlecht wachsen, wird die Kontur verstärkt, Vakuolen, Lipidtröpfchen und andere Partikel erscheinen oft im Zytoplasma, die Lücke zwischen den Zellen wird vergrößert und die Zellmorphologie ist unregelmäßig oder verliert sogar ihre ursprünglichen Eigenschaften, wie z. B. Epithelzellen werden epithelartig Zellen. Wenn Zellen sterben, können sich einige Farbstoffe mit der zerfallenen Kern-DNA durch die denaturierte Zellmembran verbinden und sie färben. Daher wird Trypanblau oft verwendet, um tote und lebendige Zellen zu identifizieren. Lebende Zellen färben sich nicht und tote Zellkerne sind blau.
2. Zellwachstum nach Primärkultur oder Inokulation einer subkultivierten Zellsuspension, es begann nach unterschiedlichen Inkubationszeiten zu proliferieren. Passagezelllinien, embryonale Gewebe oder Larvengewebe sehen im Allgemeinen am nächsten Tag Zellwachstum und können innerhalb einer Woche in Stücke verbunden werden. Nachdem die inokulierten Zellen über die gesamte Flaschenwand gewachsen sind, sollten sie rechtzeitig rekultiviert werden. Andernfalls treten die Zellen aufgrund des Nährstoffverbrauchs und der metabolischen Akkumulation in die Stopp- oder Abbauphase ein. Zu diesem Zeitpunkt wird die Zellkontur verbessert und es treten häufig körnige Ablagerungen in den Zellen auf, bei denen es sich um geschwollene Mitochondrien handelt. Das Zytoplasma wird vakuolisiert und die Zellen werden rund und rau. In schweren Fällen fallen die Zellen von der Flaschenwand ab. Nur durch rechtzeitiges Subkultivieren können die Zellen weiter wachsen und sich vermehren.
3. Unter normalen Bedingungen ist die Nährlösung pfirsichrot. Wenn die Zellen bei pH 6,5 ~ 6,6 gehalten werden, fallen die Zellen ab und sterben ab. Wenn das Kulturmedium angesäuert ist und sich gelb verfärbt, zeigt dies an, dass sich die Metaboliten im Kulturmedium bis zu einer bestimmten Menge angesammelt haben und das frische Kulturmedium ersetzt werden muss. Wenn HEPES dem Kulturmedium zugesetzt oder in einem Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert wird, kann der pH-Wert relativ stabil gehalten werden. Der Zeitpunkt des Nährlösungswechsels richtet sich nach dem Nährstoffverbrauch. Wenn die Zelle stark wächst, kann sie alle 2 bis 3 Tage gewechselt werden, und wenn das Wachstum langsam ist, kann sie auch alle 3 bis 4 Tage gewechselt werden. Dabei ist besonders zu beachten, dass verschiedene Zellen unterschiedliche Anforderungen an den pH-Wert haben.
4. Mikrobielle Kontamination Nach einer mikrobiellen Kontamination der kultivierten Zellkultur ändert sich der pH-Wert und das Kulturmedium erscheint trüb. Nach einer bakteriellen Infektion gibt es aufgrund der Bewegung von Bakterien einen leichten Blitz unter dem Lichtmikroskop; Bei einer Pilzinfektion wurden unter dem Mikroskop viele fadenförmige Hyphen und manchmal gehäufte Sporen gesehen; Eine Mykoplasmenkontamination kann nur mit Hilfe einiger Nachweisverfahren nachgewiesen werden. Nach einer Zellkontamination sollte diese generell entsorgt werden. Bei wichtigen Zelllinien können Sie sich auf relevante Monographien beziehen, um einige Maßnahmen zur Entfernung von Verschmutzungen vorzustellen. Wichtige Experimente und wertvolle Zellen sollten von mindestens zwei Experimentatoren unabhängig voneinander oder von einer Person mehrmals (zu unterschiedlichen Zeiten) kultiviert und betrieben werden. Neben den hygienischen Bedingungen des Kulturlabors steht die Luftfeuchtigkeit in engem Zusammenhang mit der mikrobiellen Belastung. Wichtige und langfristige Versuche sollten im Herbst und Winter bei geringer Luftfeuchtigkeit durchgeführt werden.
Andere Vorsichtsmaßnahmen:
Beobachten Sie zunächst häufig, um den Zellzustand zu bestimmen.
Zweitens, ob Antibiotika hinzugefügt werden sollen. Dies hängt von der Situation ab. Im Prozess der Zellkultur ist es erforderlich, möglichst wenig irrelevante Verunreinigungen hinzuzufügen. Auch Antibiotika belasten die Zellen.
Drittens das Auftauen von fötalem Rinderserum. Das Serum wird in der Regel bei - 20 °C gelagert und im Kühlschrank bei 4 °C aufgetaut, was sehr lange dauert und einen Tag vorher aufgetaut werden muss.